[摘 要] 目的：制备双特异性CAR-T（bsCAR-T）细胞，观察其对表达表皮生长因子Ⅲ型突变阳性（EGFRvⅢ+，简称vⅢ+）和CD133+胶质瘤干细胞的靶向杀伤作用。方法：基于前期研制的vⅢ/CD133双特异性微抗体和二代CAR构建的双特异性CAR（bsCAR），制备慢病毒载体转染人外周血T细胞，FCM和WB法检测bsCAR转染效率和表达水平。bsCAR-T细胞和vⅢ+/CD133+ U87胶质瘤干细胞共培养，乳酸脱氢酶（LDH）释放实验、IFN-γ分泌实验检测其特异性杀伤作用和对IFN-γ分泌的促进作用。制备裸鼠vⅢ+/CD133+ U87干细胞移植瘤模型检测bsCAR-T细胞对移植瘤生长的抑制作用。结果：vⅢscFv和CD133scFv通过重叠PCR无缝连接入二代CAR表达框（S-vⅢscFv/CD133scFv-Hinge-TM-CD137-CD3z）中，然后克隆入pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点（pbsCAR）。3种质粒（pVSV-G、pCMV-dR8.9和pbsCAR）共转染HEK293T细胞制备慢病毒载体，转染外周血T细胞，FCM检测bsCAR表达率为71.1%，WB法结果显示bsCAR表达正确。bsCAR-T细胞和vⅢ+/CD133+ U87干细胞共培养检测结果显示，bsCAR-T细胞对胶质瘤干细胞具有特异性杀伤作用，与效靶比呈正比；IFN-γ分泌量为（2 350.6±92） pg·mL-1，明显高于对照组（P<0.01）。裸鼠移植瘤动物模型显示，bsCAR-T细胞在体内具有明显的移植瘤抑制作用（P<0.01）。结论： bsCAR-T细胞能够特异性靶向杀伤vⅢ+/CD133+胶质瘤干细胞，实验结果为促进实体瘤的细胞免疫治疗提供了实验依据。
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